• Dukey
    Dukey è un cane parlante ed è il migliore amico di Johnny Test. Susan e Mary lo hanno modificato geneticamente dandogli oltre alla parola anche la capacità di praticare il kung fu.
  • Gil
    Gil è l'attraente vicino di casa di Susan e Mary che non sa nemmeno che loro esistono, nonostante siano da sempre vicini di casa. Entrambe hanno un cotta per Gil e tutti i loro esperimenti ruotano intorno a lui.
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  • Hugh e Lila Test
    Hugh e Lila sono i genitori di Johnny, Susan e Mary. Hugh è ossessionato dalla pulizia, dal cucinare il polpettone, che il resto della famiglia odia, e mette spesso in punizione i suoi tre figli per delle sciocchezze. Lila, è una donna d'affari che torna sempre a casa per cenare con la famiglia.
  • Johnny Test
    Johnny Test è un ragazzino di 11 anni che combina sempre guai e sogna di possedere dei superpoteri. Fortunatamente le sue sorelle gemelle sono delle scienziate, così lui ha la possibilità di pasticciare con i loro esperimenti. Johnny passa la maggior parte del suo tempo con il suo migliore amico, un cane parlante di nome Dukey.
  • Mister Black e Mister White
    Mr. Black e Mr. White sono dei duri agenti federali che lavorano per la Super Segreta Agenzia Governativa di Porkbelly. Loro sanno che Johnny, Dukey e le gemelle sono più capaci di loro nello sconfiggere i cattivi e lavorano duramente per mantenere questo segreto.
  • Susan e Mary
    Susan e Mary sono le due geniali sorelle gemelle di Johnny Test e lo usano spesso come soggetto test per le loro invenzioni, fatte per impressionare il loro vicino di casa Gil. Le due gemelle hanno solo 13 anni ma sono già in grado di occuparsi del Mega istituto di tecnologia di Porkbelly.
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